Les flores d’altération de la bière partie 2 : les principales bactéries d’altération de la bière

La bière constitue, par nature, un environnement particulièrement hostile au développement des micro-organismes. Plusieurs facteurs expliquent cette relative stabilité microbiologique :

• les températures élevées atteintes lors de l’ébullition du moût,
• la présence d’alcool (éthanol),
• le pouvoir bactériostatique du houblon via les acides iso-alpha,
• une faible disponibilité en oxygène,
• et des valeurs de pH basses.

Malgré ces conditions défavorables, certains micro-organismes parviennent à s’adapter à cet environnement contraignant. Ils peuvent ainsi se maintenir et se multiplier à différents endroits de la brasserie, depuis les matières premières jusqu’aux équipements et au produit fini. Parmi eux, certaines bactéries et levures sont dites altérantes, car leur développement entraîne une dégradation de la qualité de la bière.

Ces altérations se traduisent notamment par :

• des goûts et arômes indésirables,
• une acidification anormale,
• une production excessive de gaz,
• une viscosité accrue,
• ou encore une turbidité inhabituelle.

Autant de signaux révélateurs d’une contamination et donc d’une perte de maîtrise du procédé de fabrication.

Impact des microorganismes d’altération lors de la fermentation

Lors de la fermentation, la présence de microorganismes indésirables peut avoir des conséquences majeures. Ces derniers sont capables d’entrer en compétition avec les levures de fermentation volontairement ensemencées, en consommant les nutriments disponibles. Dans certains cas, ils peuvent même ralentir, voire bloquer complètement la fermentation.

Deux grands groupes de micro-organismes sont à l’origine de ces désagréments à savoir les bactéries et les levures.

Les Bactéries dont nous parlerons dans cet article : Lactobacillus - Pediococcus - Pectinatus - Megasphaera - Acetobacter - Gluconobacter - Zymomonas - Obesumbacterium - Citrobacter freundii - Klebsiella terrigena et Oxytoca - Rahnella aquatilis

Voici ci-dessous un aperçu de l’ensemble des flores d’altération pouvant se retrouver dans la bière ou à la brasserie. Les microorganismes les plus fréquemment rencontrés sont les bactéries lactiques (en orange ci-dessous) qui sont responsables de la majeure partie des contaminations à la brasserie, les bactéries anaérobies (en jaune), et bien entendu les levures sauvages avec, en violet les Saccharomyces et en bleu, les non Saccharomyces.

Les flores d’altération les plus fréquemment rencontrées en brasserie sont les bactéries lactiques, responsables de la majorité des contaminations, suivies des bactéries anaérobies strictes, puis des levures sauvages, incluant les Saccharomyces et les non-Saccharomyces

Pourquoi la bière est-elle sélective sur le plan microbiologique ?

Le moût est souvent qualifié de « bouillon de culture », tant il est riche en sucres, acides aminés et minéraux favorables au développement microbien. À l’inverse, la bière est considérée comme une boisson microbiologiquement stable.

Cette stabilité repose sur une combinaison de facteurs inhibiteurs :

• alcool : 0,5 à 10 % v/v,
• acides iso-alpha du houblon : 17 à 55 ppm,
• CO₂ dissous : environ 0,5 % (m/m),
• oxygène dissous très faible (< 0,1 ppm),
• pH bas : généralement compris entre 3,7 et 4,8.

Ces conditions créent une pression de sélection importante, ne permettant la survie que de microorganismes particulièrement adaptés.

Si les bactéries à Gram positif sont les plus fréquemment rencontrées en brasserie, certaines bactéries à Gram négatif sont également impliquées dans l’altération de la bière.

LES BACTERIES LACTIQUES (GRAM POSITIF)

Les bactéries lactiques sont des bactéries à Gram positif, apparaissant bleu-violet au microscope après coloration de Gram. Bien que la majorité d’entre elles ne survivent pas dans la bière, certaines espèces appartenant aux genres Lactobacillus et Pediococcus ont développé des mécanismes d’adaptation leur permettant de s’y maintenir et de s’y multiplier.

Elles représentent de loin les flores d’altération les plus fréquemment rencontrées en brasserie.

Un double visage : utiles ou nuisibles

Les bactéries lactiques produisent principalement de l’acide lactique, un acide relativement doux. Lorsqu’elles sont utilisées volontairement et maîtrisées, elles participent à l’élaboration de styles spécifiques :

• bières acides (« sour beers »),
• Berliner Weisse,
• Gose,
• bières de fermentation spontanée (lambic).

Dans ces contextes, elles apportent fraîcheur, acidité et complexité aromatique.

En revanche, lorsqu’elles sont présentes de manière non intentionnelle, elles deviennent un problème majeur. Lactobacillus et Pediococcus sont responsables de 60 à 90 % des contaminations en brasserie [Back, 2003]. Leur dangerosité est renforcée par leur capacité à développer une résistance au houblon, notamment via les gènes horA et horC [Suzuki et al., 2005].

Le houblon, au-delà de ses qualités aromatiques, joue un rôle fondamental dans la conservation de la bière grâce à son effet bactériostatique. Toutefois, certaines bactéries lactiques résistantes aux iso-alpha-acides peuvent contourner ce mécanisme et proliférer malgré un houblonnage important.

Il est donc essentiel, pour une brasserie, de différencier les souches résistantes au houblon de celles qui ne le sont pas, afin d’évaluer correctement le risque d’altération.

Détection et limites des méthodes classiques

La mise en évidence des gènes de résistance au houblon (horA, horC) ne peut être réalisée de façon fiable que par des méthodes de biologie moléculaire, notamment la PCR (Polymerase Chain Reaction), aujourd’hui accessibles en routine en brasserie.

Les méthodes de culture classiques présentent en effet de nombreuses limites :

• développement lent,
• forte variabilité des résultats,
• risque élevé de faux négatifs,
• existence de bactéries viables mais non cultivables (VBNC), dues au stress imposé par la matrice bière (alcool, pH, houblon).

La biologie moléculaire s’impose ainsi comme l’outil le plus fiable pour le contrôle microbiologique moderne en brasserie.

LACTOBACILLUS

Les Lactobacillus sont des bacilles à Gram positif, anaérobies mais tolérants à l’oxygène. Plus d’une centaine d’espèces sont connues, dont une quinzaine impliquées dans l’altération de la bière.

L’espèce la plus fréquemment rencontrée est Lactobacillus brevis, hétéro-fermentaire, avec une croissance optimale autour de 30 °C et un pH compris entre 4 et 6.

Lactobacillus lindneri est également notable pour sa résistance au houblon et sa capacité à se développer à des températures relativement basses (19–23 °C).

Espèces fréquemment impliquées :
L. brevis, L. lindneri, L. buchneri, L. parabuchneri, L. casei, L. coryneformis, L. malefermentans, L. curvatus.

Ces bactéries sont particulièrement difficiles à détecter par culture en raison de leur état de stress et de dormance possible.

Lactobacillus

PEDIOCOCCUS

Les Pediococcus sont des coques à Gram positif, homo-fermentaires, tolérantes à l’oxygène. Elles transforment le glucose exclusivement en acide lactique et sont connues pour leur production de diacétyle, responsable d’arômes de beurre ou de pop-corn.

Espèces couramment rencontrées :
P. damnosus, P. acidilactici, P. pentosaceus, P. parvulus, P. dextrinicus, etc.

Pediococcus damnosus est particulièrement problématique en raison de sa capacité à se développer à basse température, ce qui lui permet d’altérer la bière durant la fermentation, la garde ou même le stockage.

Pediococcus

LES BACTERIES ANAEROBIES (GRAM NEGATIF)

Parmi les bactéries à Gram négatif, seules quelques-unes sont responsables d’altération de la bière. On distingue :

• les anaérobies strictes (Pectinatus, Megasphaera, Zymophilus),
• les aéro-anaérobies facultatives (bactéries acétiques, Zymomonas, entérobactéries).

Les genres Pectinatus et Megasphaera sont les plus fréquemment impliqués. Contrairement aux bactéries lactiques, elles ne présentent aucun intérêt technologique et leur présence traduit systématiquement un défaut d’hygiène ou de nettoyage.

PECTINATUS

Bacilles à Gram négatif, fortement mobiles grâce à de nombreux flagelles. Ils se développent préférentiellement dans les bières faiblement alcoolisées (< 5 %) et dans des conditions anaérobies, notamment au conditionnement.

Ils sont responsables d’odeurs d’œuf pourri (H₂S) et produisent divers acides organiques et composés soufrés.

Pectinatus sottacetonis sp. nov. isolated from commercial pickle spoilage tank. - Scientific Figure on ResearchGate. Available from: researchgate.net/figure/Scanning-electron-micrograph-of-cells-of-Pectinatus-sottacetonis-sp-nov-showing_fig2_236254969

MEGASPHAERA

Coques légèrement ovales à Gram négatif. Plusieurs espèces (M. cerevisiae, M. paucivorans, M. sueciensis) ont été associées à des contaminations de bière.

Elles produisent notamment :
H₂S, acides butyrique, isobutyrique, caproïque, valérique et isovalérique.

Megasphaera

AUTRES BACTERIES ANAEROBIES STRICTES (mais moins courantes)

Le genre Selenomonas comprend près de 10 espèces, mais seule Selenomonas lacticifex, a été mise en évidence pour son altération de la bière [Schleifer et al., 1990] et plus récemment identifiée sur un biofilm à la surface d’un équipement au niveau de l’embouteillage [Vávrová et al., 2014]. Ce microorganisme va conduire à une odeur désagréable du fait de la production d’acides acétique et propionique.

On peut également retrouver le genre Zymophilus, pour lequel il existe deux espèces Z. paucivorans et Z. raffinosivorans que l’on peut mettre en évidence dans la cuve de brassage, le levurier ou également les déchets issus de la production de la bière. Les Zymophilus sont des bacilles, légèrement incurvés qui sont isolés, par deux ou parfois en courte chainette. Ils se trouvent dans les bières de garde (pas présents dans les bières de types lager), et vont produire des arômes non souhaités : fruits, pomme pourrie, œuf pourri, sulfureux. Ces arômes indésirables sont générés par la production d’acétaldéhyde et H2S.

LES BACTERIES ACETIQUES

Les bactéries acétiques (famille Acetobacteriaceae) oxydent l’éthanol en acide acétique. Elles sont peu sensibles à l’alcool, au pH acide et au houblon, mais nécessitent de l’oxygène pour se développer.

Les genres Acetobacter et Gluconobacter sont les plus souvent impliqués, notamment lors de l’embouteillage, du vieillissement en fût ou en présence de défauts d’oxygénation.

ACETOBACTER

Parmi les espèces de bactéries qui produisent de l’acide acétique, dix espèces d’Acetobacter sont retrouvées dans les environnements de brassage dont les plus fréquemment A. aceti, A. liquefaciens, A. pastorianus et A. hansii. On va les retrouver plus particulièrement au niveau du moût, conditionnement en fût, bières vieillies en fût ou encore sous forme de biofilm dans la brasserie. Elles vont produire des arômes aigres, vinaigrés du fait de la production d’acide acétique.

Acetobacter- source MD Agrotech

GLUCONOBACTER

Une seule espèce de Gluconobacter (G.oxydans) serait régulièrement associée à des contaminations dans les environnements de brassage, mais G.cerevisiae peut également être rencontré. On peut retrouver ces micro-organismes dans le moût, lors de d’embouteillage, bières vieillies en fût. Ils vont produire des arômes aigres, vinaigrés du fait de la production d’acide acétique et acétate.

ZYMOMONAS

Les bactéries du genre Zymomonas peuvent se développer en présence ou en absence d’oxygène et tolérantes à l’éthanol (moins de 10% d’éthanol). Ce microorganisme va se développer de manière optimale avec un pH supérieur à 3,4 et une température comprise entre 25°C et 30°C.

Zymomonas - Photo : Katherine Pappas, University of Athens

On va le retrouver dans des bières de garde (non retrouvé dans les bières de type lager), et se caractériser par des arômes fuités, pomme pourrie, œuf pourri qui sont produits par l’éthanal (acétaldéhyde) et sulfure d’hydrogène (H2S).

LES ENTEROBACTERIES

Les entérobactéries sont des bacilles à Gram négatif, présents dans l’environnement, le sol, l’eau et les matières premières. Elles sont principalement actives aux premières étapes du brassage et ne survivent généralement pas dans la bière finie.

Leur présence est un indicateur clair de mauvaises conditions d’hygiène.

Parmi elles :
Obesumbacterium proteus, Citrobacter freundii, Klebsiella oxytoca, K. terrigena, Rahnella aquatilis.

Enterobactéries

OBESUMBACTERIUM

AUTRES ENTEROBACTERIES A LA BRASSERIE

Parmi les autres Entérobactéries retrouvées dans la bière, on peut noter les Citrobacter freundii, Rahnella aquatilis, Klebsiella oxytoca et Klebsiella terrigena dont la présence a déjà été signalée dans du moût non fermenté et en fermentation.

CITROBACTER FREUNDII

Bactérie bacille gram négatif, anaérobie facultative, catalase positive. Bactéries qui sont inhibées par l’éthanol et n’apparaîtront qu’aux premiers stades de la fermentation. Il a été démontré que leur présence accélère le processus de fermentation et induit une production importante de diacétyle, d'acide lactique, d'acétaldéhyde et de sulfure de diméthyle (DMS).

Citrobacter freundii

KLEBSIELLA TERRIGENA et OXYTOCA

Bactérie bacille gram négatif, anaérobie facultatif, catalase positive, immobile et capsulée. Ces bactéries ont déjà été signalées dans l’environnement de la brasserie. Dans le moût elles produisent des arômes phénoliques par la formation de 4-vinylguaiacol produit à partir de la décarboxylation de l'acide férulique. Phénomène que l’on va également retrouver avec certaines levures sauvages.

RAHNELLA AQUATILIS

Bactérie qui a été isolée dans diverses sources comme par exemple : le sol, l’eau, les aliments, la matière première végétale et parfois même dans des échantillons cliniques. Concernant l’environnement de la brasserie, cette bactérie a été signalée comme probable contaminant dans la levure lors de fermentation haute et dans le moût fermenté.

Rahnella aquatilis -  source : Patricia Sobecky

Les flores d’altération de la bière, partie 1: « Amies » ou « Ennemies » ?

Partie 3 : Les principales levures sauvages d’altération de la bière

Références:
Back W. 1981. Bierschadliche Bakterien – Taxonomie der bierschaldlichen Bakterien. Monatsschrift fur Brauerie, 34
Back W. 2003. Bioflime in der Brauerie und Getrankeindustrie – Brauwelt Online 23/25 1-5
Hill A.E 2015. Brewing Microbiology - 1st Edition
Priest F.G. 1987. Brewing Microbiology. Elsevier Applied Science
Suzuki K et al 2005. Isolation of hop-sensitive variant from Lactobacillus lindneri and identification of genetic marker for beer spoilage ability of lactic acid bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 71, 5089-5097
Suzuki K. 2012. 125th Anniversary review. Microbiological instability of beer caused by spoilage bacteria. Journal of the institute of brewing, 117