La bière présente un environnement hostile pour la contamination et le développement des micro-organismes pour plusieurs raisons : conditions lors de l’ébullition du moût (haute température), fort taux en alcool du produit, pouvoir bactériostatique du houblon ou encore des valeurs de pH très basses. Cependant même dans ces conditions stressantes et non propices au développement, certains micro-organismes s’adaptent à l’environnement et vont donc se retrouver nichés à différents niveaux de la brasserie. Parmi ces microorganismes, nous allons retrouver des bactéries ou levures qui en plus d’être présentes vont également altérer le produit. Elles peuvent être responsables de différentes altérations dont le mauvais goût, l’acidification anormale, les arômes indésirables, la production de gaz en abondance, la viscosité importante, en bref une indication de contamination et donc de non maîtrise de son produit.
Pendant la période de fermentation ces microorganismes d’altération, si présents, vont être capables de prendre le dessus sur les souches utilisées volontairement pour la production de la bière, et utiliser les nutriments à disposition à la place de la levure initialement prévue pour la fabrication. Ils peuvent également stopper ou réduire la fermentation.
Deux grands groupes de micro-organismes sont à l’origine de ces désagréments à savoir les bactéries et les levures.
Les Bactéries dont nous parlerons dans cet article : Lactobacillus - Pediococcus - Pectinatus - Megasphaera - Acetobacter - Gluconobacter - Zymomonas - Obesumbacterium - Citrobacter freundii - Klebsiella terrigena et Oxytoca - Rahnella aquatilis
Voici ci-dessous un aperçu de l’ensemble des flores d’altération pouvant se retrouver dans la bière ou à la brasserie. Les microorganismes les plus fréquemment rencontrés sont les bactéries lactiques (en orange ci-dessous) qui sont responsables de la majeure partie des contaminations à la brasserie, les bactéries anaérobies (en jaune), et bien entendu les levures sauvages avec, en violet les Saccharomyces et en bleu, les non Saccharomyces.
Regardons maintenant plus en détail, les bactéries principalement retrouvées à la brasserie.
Alors que le moût est considéré comme un bouillon de culture riche en divers substrats permettant le développement des micro-organismes, la bière est quant à elle considérée comme une boisson microbiologiquement stable. En effet la présence d’alcool (éthanol) à hauteur de 0,5 à 10%, de houblon avec les acides iso alpha (17-55ppm), un niveau élevé en CO2 (0,5% w/v), une teneur en oxygène très faible (<0,1 ppm), un taux de pH bas (3,7 – 4,8) sont autant de paramètres qui font de la bière une matrice complexe, il y a donc une sélection naturelle qui s’y opère dans un environnement stressant pour un grand nombre de micro-organismes.
Alors que les bactéries à Gram (caractéristique membranaire de la paroi de la bactérie, taxonomie) positif sont les microorganismes les plus souvent rencontrés à la brasserie, il est aussi possible de rencontrer des bactéries à Gram négatif responsables de détérioration de la bière. Voici les bactéries fréquemment rencontrées à la brasserie :
LES BACTERIES LACTIQUES (GRAM POSITIF)
Ce sont des bactéries à Gram positif, cela signifie que suite aux étapes de colorations réalisées sur la bactérie, celle-ci va apparaitre bleu-violet au microscope. Ces microorganismes ne peuvent généralement pas survivre dans la bière, cependant certaines espèces des genres Lactobacillus et Pediococcus, également désignées sous le nom de « bactéries lactiques » peuvent survivre et se développer. Les bactéries lactiques sont considérées comme les flores d’altération les plus souvent rencontrées à la brasserie.
Les bactéries qui produisent des acides lactiques peuvent causer de nombreux dégâts dans la bière, mais à l’inverse, lorsque leur utilisation est souhaitée et maîtrisée, elles contribuent à la fabrication de certaines bières. En effet l’acide lactique produit par ces bactéries est un acide doux. Ainsi on va retrouver son utilisation dans les bières de type « Sour beer », bières de blé, comme par exemple les « Berliner weisse » ou encore les « gose ». Généralement des bières qui présentent donc une acidité, une fraîcheur en bouche, souvent un niveau d’alcool faible et généralement l’ajout d’une petite touche fruitée. Les bactéries lactiques seront également retrouvées dans les bières à fermentation spontanée, exemple type lambic.
Cependant, si ces bactéries ne font pas partie intégrante de la recette du brasseur et qu’elles se retrouvent présentes et de façon non contrôlée elles vont avoir un impact très important sur le produit. Les bactéries lactiques (Lactobacillus et Pediococcus) sont considérées comme les ennemies N°1 du brasseur et vont être responsables de 60% à 90% des problématiques de contaminations à la brasserie [Back 2003]. S’ajoute à cela le fait que ces bactéries, qui produisent des acides lactiques peuvent également présenter une forte résistance aux acides iso alpha du houblon [Suzuki et al 2005]. En effet le houblon au-delà de l’amertume et du parfum qu’il va apporter, présente également l’intérêt majeur de participer à la conservation de la bière par son action bactériostatique. C’est-à-dire la capacité à empêcher le développement des bactéries dans la bière et ainsi éviter tout risque de développement et donc d’altération du produit. Mais force est de constater que les propriétés conservatrices du houblon peuvent être considérablement amoindries en cas de contamination de la bière par certaines bactéries lactiques dotées des gènes de résistance au houblon (horA et horC). Le houblon a moins d’impact sur leur croissance et ne parvient pas à empêcher la prolifération de ce type de bactéries dans la bière.
Il y a donc, à la brasserie, un intérêt à pouvoir différencier les bactéries lactiques possédant ces gènes de celles qui n’en ont pas, car cela permet d’évaluer le niveau de risque lié à la détérioration de la qualité finale du produit. Mettre en évidence la présence de ces bactéries avec ces gènes de résistance aux houblons à la brasserie montre une menace réelle pour la qualité de son produit et donc la nécessité d’une action stricte afin d’écarter cette menace. La même bactérie sans ces gènes de résistance, indique également la présence de flores d’altération, mais celle-ci pourra être atténuée au cours du processus de fabrication ou par l’action du houblon. Cependant cette présence n’étant pas souhaitée, il sera important d’en comprendre les raisons
La détection de bactéries lactiques résistantes au houblon (gènes horA et horC) n’est possible, en routine, que sur une plateforme de biologie moléculaire (PCR : Polymerase Chain Reaction). Ce contrôle peut-être mis directement en place à la brasserie.
La biologie moléculaire est l’outil idéal et recommandé pour la mise en évidence des flores d’altération à la brasserie. En effet le développement des micro-organismes (ex : les bactéries lactiques) sur des supports avec substrats type géloses (boîte de Petri, lame,…), milieux liquides (flacons, tubes,…) n’apporte pas une totale satisfaction, car beaucoup de paramètres vont influer sur le développement de la bactérie ou de la levure. Ainsi il est souvent constaté des variabilités importantes sur un même échantillon voire même des résultats faux négatifs : on parle ici par exemple de « bactéries viables mais non cultivables » du fait des conditions stressantes de la matrice bière. Ce qui conduit donc la brasserie à avoir des risques d’échecs de détection et donc d’obtenir des résultats négatifs [Suzuki 2012]. Les microorganismes qui vont se retrouver sur ces milieux de culture vont être stressés (profil nutritionnel, pH différent de celui de la bière) et ne vont donc pas efficacement utiliser les substrats et donc, ne vont pas se développer ou prendre plus de temps pour apparaitre (plus de 3 jours).
Voici quelques informations complémentaires sur les différentes bactéries lactiques :
LACTOBACILLUS
Les Lactobacillus sont des bactéries anaérobies partiellement tolérantes à l’oxygène, elles vont être capables de se développer quelque-soit la teneur en oxygène. Au microscope elles sont visibles sous forme de bâtonnet (bacille Gram positif), non sporulées. Il existe plus d’une centaine d’espèces, mais seulement une quizaine sont reconnues comme flores d’altération de la bière. L’espèce la plus rencontrée est Lactobacillus brevis, qui est hétéro fermentaire (produit de l’alcool ou acide lactique à partir des sucres), et se développe de façon optimale à 30°C et pH de 4 à 6.
La seconde espèce de Lactobacillus le plus rencontrée est Lactobacillus lindneri qui présente notamment des résistances au houblon [Back, 1981] et se développe de manière optimale entre 19 et 23°C [Priest , 1987] mais est capable de survivre à des températures plus élevées que les autres bactéries lactiques.
Lactobacillus
Voici la liste des espèces de Lactobacillus les plus souvent rencontrées à la brasserie et provoquant des altérations de la bière : brevis, lindneri, buchneri, parabuchneri, casei, coryneformis, malefermentans, curvatu.
Les Lactobaccillus sont considérés comme des microorganismes se développant difficilement sur milieux de culture et risquent de passer entre les mailles des filets de la détection, provoquant ainsi des détériorations du produit. En plus du milieu de culture qui ne va pas favoriser le développement de la bactérie, il y a aussi le fait que la bactérie dans la bière se trouve exposée à de nombreux éléments stressants (alcool, pH bas, houblon, température,…). Ainsi, la bactérie de par le stress, peut se retrouver en état de dormance et ne sera pas en mesure de se développer : « bactéries viables mais non cultivables ».
PEDIOCOCCUS
Les Pediococcus sont des bactéries anaérobies partiellement tolérantes à l’oxygène, elles vont être capables de se développer quelque-soit la teneur en oxygène. Au microscope elles sont visibles sous forme ovale (coque à gram positive), elles sont homo fermentaires (le glucose est transformé en acides lactiques). Pedioccocus va détériorer la bière notamment par la production d’un sous-produit qui est le diacétyle lors de la fermentation (goût de pop-corn beurré).
Voici la liste des espèces de Pediococcus les plus souvent rencontrés à la brasserie et provoquant des altérations de la bière : damnosus, acidilactici, pentosaceus, parvulus, inopinatus, halophilus, dextrinicus et urinaeequi.
Le Pediococcus damnosus, par exemple, a la capacité de se développer à des températures plutôt basse et sa température optimale de croissance se situe entre 22 et 25°C. En raison de sa capacité à croître même à basse température, une détérioration peut se produire à différents stades de la fabrication (fermentation, garde), ainsi que lors du stockage. De plus tout comme les Lactobacillus, les Pediococcus peuvent également développer une résistance au houblon.
Pediococcus
Passons maintenant aux bactéries à gram négatif :
LES BACTERIES ANAEROBIES (GRAM NEGATIF)
Seules quelques bactéries Gram négatif sont identifiées comme responsables d’altération de la bière. Il est possible de différencier deux catégories : les bactéries anaérobies strictes et plus précisément les genres bactériens Pectinatus, Megasphaera et Zymophilus ; les bactéries aéro-anaérobies facultatives, telles que les bactéries productrices de l’acide acétique, Zymomonas, ainsi que certaines espèces d’Entérobactéries.
Dans l’ensemble de ces microorganismes à Gram négatif, ce sont Pectinatus et Megasphaera les plus rencontrées lors d’altération de la bière. Contrairement aux bactéries lactiques, qui peuvent être utilisées volontairement, les Megasphaera et Pectinatus ne présentent aucun intérêt à la brasserie et ne contribuent qu’à détériorer le produit [Sakamoto et Konings, 2003]. Si elles sont mises en évidence cela signifie qu’il y a obligatoirement une situation de contamination, un risque d’altération et donc la nécessité d’une action pour isoler la contamination et la l’éradiquer. Ces deux genres bactériens vont se trouver dans des zones de la brasserie où elles vont pouvoir se nicher et même pouvoir survivre pendant des années sans forcément induire tout de suite des défauts sur le produit [Hakalehto, 2000]. Leur présence va souvent apparaitre suite à une négligence de nettoyage et donc un développement de ces microorganismes à la brasserie induisant une propagation dans le produit et aboutissant à sa détérioration.
Regardons dans le détail les bactéries à Gram négatif :
PECTINATUS
Les Pectinatus sont des bacilles à Gram négatif. Le nom de la bactérie vient du latin « pecten » qui signifie peigne car la bactérie est dotée de nombreux flagelles (filament mobile permettant le déplacement) lui apportant une grande capacité de mobilité. Ce micro-organisme peut se développer entre 15 et 40°C, avec une température optimale de croissance comprise entre 28 et 32°C. Au-delà de 50°C la bactérie ne résiste pas.
Une des caractéristiques importantes pour le monde de la brasserie est que cette bactérie va se développer principalement dans des bières à faible teneur en alcool et plus précisément à des valeurs <5%. Ce microorganisme, du fait de ces caractéristiques va souvent se retrouver au niveau de l’embouteillage et zones de stockage (conditions anaérobies). Son impact est non négligeable puisqu’elle va développer, par l’utilisation des substrats, des arômes d’œuf pourri liés à la production de H2S. Au-delà de ça, la bactérie va pouvoir aussi développer différents types de métabolismes conduisant à la production d’acide acétique, acide propionique, acide lactique, acide succinique, acétoïne, méthylmercaptan et autres composés soufrés.
Pectinatus sottacetonis sp. nov. isolated from commercial pickle spoilage tank. - Scientific Figure on ResearchGate. Available from: researchgate.net/figure/Scanning-electron-micrograph-of-cells-of-Pectinatus-sottacetonis-sp-nov-showing_fig2_236254969
MEGASPHAERA
Les Megasphaera sont des bactéries légèrement ovales, coques à gram négatif. Cinq espèces sont distinguées au sein du genre Megasphaera dont M.cerevisiae, M.paucivorans et M.sueciensis celles-ci ont été retrouvées dans des cas de contamination de la bière.
Comme Pectinatus, Megasphaera va présenter des caractéristiques similaires, à savoir se développer à des faibles niveaux d’alcool, se retrouver au niveau de l’embouteillage, zone de stockage et va produire des arômes indésirables. Exemples d’éléments qui peuvent être produits par la bactérie : H2S, acide butyrique, acide isobutyrique, acide caproic, acide valérique, acide isovalérique.
Megasphaera
AUTRES BACTERIES ANAEROBIES STRICTES (mais moins courantes)
Le genre Selenomonas comprend près de 10 espèces, mais seule Selenomonas lacticifex, a été mise en évidence pour son altération de la bière [Schleifer et al., 1990] et plus récemment identifiée sur un biofilm à la surface d’un équipement au niveau de l’embouteillage [Vávrová et al., 2014]. Ce microorganisme va conduire à une odeur désagréable du fait de la production d’acides acétique et propionique.
On peut également retrouver le genre Zymophilus, pour lequel il existe deux espèces Z. paucivorans et Z. raffinosivorans que l’on peut mettre en évidence dans la cuve de brassage, le levurier ou également les déchets issus de la production de la bière. Les Zymophilus sont des bacilles, légèrement incurvés qui sont isolés, par deux ou parfois en courte chainette. Ils se trouvent dans les bières de garde (pas présents dans les bières de types lager), et vont produire des arômes non souhaités : fruits, pomme pourrie, œuf pourri, sulfureux. Ces arômes indésirables sont générés par la production d’acétaldéhyde et H2S.
LES BACTERIES ACETIQUES
Les bactéries acétiques oxydent généralement l’éthanol pour former de l’acide acétique (goût de vinaigre) et sont au niveau de l’industrie agro-alimentaire utilisées pour la production commerciale de vinaigre. Cette famille de bactéries à Gram négatif : Acétobacteriaceae comprend une dizaine de genres dont les plus courants sont Acetobacter, Gluconobacter et Gluconacetobacter.
Les bactéries qui produisent de l’acide acétique sont largement retrouvées sur les plantes, les fruits, et donc dans l’air. Leur présence dans la bière va causer de graves détériorations du produit, notamment lors des étapes où il y a présence d’oxygène. Ce sont des bactéries qui ne sont pas inhibées par les acides et l’éthanol. De plus elles ne sont pas affectées par le houblon (acides iso-alpha). Lorsqu’elles sont présentes dans la bière elles vont se développer rapidement et produire des arômes acides et apporter de la turbidité à la bière. Elles viennent contaminer le produit généralement à l’embouteillage car elles ont besoin d’oxygène pour se développer ou lors de la distribution en fût. Cependant tant que la bière est correctement stockée, avec un niveau bas d’oxygène, ce micro-organisme ne pourra pas se développer.
ACETOBACTER
Parmi les espèces de bactéries qui produisent de l’acide acétique, dix espèces d’Acetobacter sont retrouvées dans les environnements de brassage dont les plus fréquemment A. aceti, A. liquefaciens, A. pastorianus et A. hansii. On va les retrouver plus particulièrement au niveau du moût, conditionnement en fût, bières vieillies en fût ou encore sous forme de biofilm dans la brasserie. Elles vont produire des arômes aigres, vinaigrés du fait de la production d’acide acétique.
Acetobacter- source MD Agrotech
GLUCONOBACTER
Une seule espèce de Gluconobacter (G.oxydans) serait régulièrement associée à des contaminations dans les environnements de brassage, mais G.cerevisiae peut également être rencontré. On peut retrouver ces micro-organismes dans le moût, lors de d’embouteillage, bières vieillies en fût. Ils vont produire des arômes aigres, vinaigrés du fait de la production d’acide acétique et acétate.
ZYMOMONAS
Les bactéries du genre Zymomonas peuvent se développer en présence ou en absence d’oxygène et tolérantes à l’éthanol (moins de 10% d’éthanol). Ce microorganisme va se développer de manière optimale avec un pH supérieur à 3,4 et une température comprise entre 25°C et 30°C.
Zymomonas - Photo : Katherine Pappas, University of Athens
On va le retrouver dans des bières de garde (non retrouvé dans les bières de type lager), et se caractériser par des arômes fuités, pomme pourrie, œuf pourri qui sont produits par l’éthanal (acétaldéhyde) et sulfure d’hydrogène (H2S).
LES ENTEROBACTERIES
La famille des Enterobacteriacea est une très grande famille de bactéries, qui sont des bacilles à Gram négatif, oxydase négative et aéro-anaérobie (capacité de se développer en présence ou en absence d’oxygène). Elles sont présentes partout dans le sol, dans l’eau et sont naturellement retrouvées dans l’intestin de l’homme et des animaux.
Plusieurs espèces appartiennent aux Enterobacteriacea par exemple Obesumbacterium, Hafnia, Klebsiella et Citrobacter qui sont associées à des altérations du moût fermenté et non fermenté. Ces microorganismes sont capables d’utiliser le lactose avec formation de gaz et d’acides en l’espace de 48H à des températures entre 35-37°C.
Ces bactéries ne sont normalement pas capables de se développer dans le produit fini, mais il est possible de les retrouver dès les premières étapes du processus de fabrication de la bière (brassage) pouvant induire à la production d’arômes indésirables à cette étape qui seront retrouvés dans le produit fini.
La présence de ces bactéries indique également que les conditions d’hygiène ne sont pas correctes à la brasserie.
Enterobactéries
OBESUMBACTERIUM
Cette bactérie peut être retrouvée dans la levure et dans le moût , elle n’a jamais été retrouvée dans le produit fini car ne pousse pas à des pH faibles.
Obesumbacterium proteus est rencontrée aux premiers stades de la fermentation où elle va rentrer en compétition avec la levure pour utiliser les nutriments, ceci va provoquer des ralentissements de fermentation. O. proteus est capable de produire des métabolites tels que le diméthylsulfoxyde (DMSO), l’acétoïne, l’acide lactique, le propanol, l’isobutanol et le 2,3-butanediaol. Le DMS va induire une saveur de panais (goût de noisette, sucré, épicé), sulfuré dans une bière contaminée
AUTRES ENTEROBACTERIES A LA BRASSERIE
Parmi les autres Entérobactéries retrouvées dans la bière, on peut noter les Citrobacter freundii, Rahnella aquatilis, Klebsiella oxytoca et Klebsiella terrigena dont la présence a déjà été signalée dans du moût non fermenté et en fermentation.
CITROBACTER FREUNDII
Bactérie bacille gram négatif, anaérobie facultative, catalase positive. Bactéries qui sont inhibées par l’éthanol et n’apparaîtront qu’aux premiers stades de la fermentation. Il a été démontré que leur présence accélère le processus de fermentation et induit une production importante de diacétyle, d'acide lactique, d'acétaldéhyde et de sulfure de diméthyle (DMS).
Citrobacter freundii
KLEBSIELLA TERRIGENA et OXYTOCA
Bactérie bacille gram négatif, anaérobie facultatif, catalase positive, immobile et capsulée. Ces bactéries ont déjà été signalées dans l’environnement de la brasserie. Dans le moût elles produisent des arômes phénoliques par la formation de 4-vinylguaiacol produit à partir de la décarboxylation de l'acide férulique. Phénomène que l’on va également retrouver avec certaines levures sauvages.
RAHNELLA AQUATILIS
Bactérie qui a été isolée dans diverses sources comme par exemple : le sol, l’eau, les aliments, la matière première végétale et parfois même dans des échantillons cliniques. Concernant l’environnement de la brasserie, cette bactérie a été signalée comme probable contaminant dans la levure lors de fermentation haute et dans le moût fermenté.
Rahnella aquatilis - source : Patricia Sobecky
Points clés:
- Les bactéries lactiques (Lactobacillus et Pediococcus) sont responsables de 60-90% des contaminations à la brasserie.
- Les bactéries lactiques issues de la bière sont ont une croissance difficile sur milieu de culture traditionnel, le stress induit par la bière (houblon, pH, alcool,…) ne permet pas le bon développement des bactéries et induit donc un risque non négligeable de résultats faux négatifs .
- La résistance des bactéries lactiques au houblon (gènes hor A et hor C) peut seulement être détectée par méthode PCR.
- Les bactéries anaérobies (Megasphaera et Pectinatus) ne sont généralement rencontrées que dans les bières dont le taux d’alcool est <5% et dans des conditions à faible taux en oxygène.
Sophie TABURIAUX, Ingénieur Microbiologie - bioMérieux
Les flores d’altération de la bière, partie 1: « Amies » ou « Ennemies » ?
Partie 3 : Les principales levures sauvages d’altération de la bière
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Références:
Back W. 1981. Bierschadliche Bakterien – Taxonomie der bierschaldlichen Bakterien. Monatsschrift fur Brauerie, 34
Back W. 2003. Bioflime in der Brauerie und Getrankeindustrie – Brauwelt Online 23/25 1-5
Hill A.E 2015. Brewing Microbiology - 1st Edition
Priest F.G. 1987. Brewing Microbiology. Elsevier Applied Science
Suzuki K et al 2005. Isolation of hop-sensitive variant from Lactobacillus lindneri and identification of genetic marker for beer spoilage ability of lactic acid bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 71, 5089-5097
Suzuki K. 2012. 125th Anniversary review. Microbiological instability of beer caused by spoilage bacteria. Journal of the institute of brewing, 117
